实用技术

猪伪狂犬病的八种实验室诊断方法

伪狂犬病(Pseudorabies,PR)最早报道于20世纪初,曾席卷整个欧洲地区,造成了巨大经济损失。1947年,我国猪伪狂犬病的实验室诊断方法首次在猫身上分离到了伪狂犬病毒,并开始快速传播,2011年,我国出现了变异毒株,对我国的畜牧业,尤其是养猪业造成巨大威胁。目前,大部分欧洲发达国家已经根除传统的PR,但在我国仍频繁发生,并混杂变异毒株的感染,根除难度大,如何研制出更加高效的基因疫苗、阻止病毒的肆意传播尤为重要。

通过临床表现只能做出初步诊断,确诊还需进行实验室检查。现将常用的实验室诊断法介绍如下。

1、病原的分离鉴定:采集新鲜的病料。可取病猪的各个脏器组织碎块作为病料,用经灭菌后的PBS进行匀浆处理,添加双抗置于4℃过夜,离心后取上清接种于易感单程细胞(如Vero、PK-15、Hela、BHK-1等)上,等待观察病变,如未出现病变,可盲传一代再观察。此方法可确诊伪狂犬病毒,但灵敏性较低。

2、ELISA法:利用抗原-抗体特异性结合的原理进行抗原的检测,可用于大量样品的检测。此方法的类型很多,包括普通的ELISA法、双抗加心、斑点ELISA、竞争ELISA、鉴别诊断ELISA等,各种方法细节略有不同,但都操作简单,易于推广。经大量实验数据表明,病猪的脑组织、肺脏和扁桃体取样所检出伪狂犬病毒的检出率较高,且结果准确。

3、PCR技术:此方法快速、高效、特异性强,需要一定的实验技术水平。目前,DNA提取试剂盒已经普遍,可以方便、快速地从病料组织中提取目的DNA,设计伪狂犬病毒的特异性保守序列引物,进行PCR扩增,用琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。

4、DNA探针技术:以PCR技术作为基础,将伪狂犬病毒的一段保守片段进行克隆作为探针材料,进行目的基因的扩增。结果准确、灵敏度高,但此方法操作复杂,成本较高。

5、中和实验:将病毒接种于单层细胞进行传代培养,用特性的抗体进行微量血清中和实验,易于判断结果,可用于大量样品的检测,但整体效果低于ELISA检测法。

6、免疫荧光技术:此方法是利用荧光色素对待检抗原或抗体先进行免疫荧光标记,再进行抗原-抗体结合实验,进行荧光标记的示踪。目前,此方法被证实可直接用于检测病猪的脏器组织,其中,淋巴结和扁桃体的检出率最高。

7、免疫接种试验:可将分离好的病毒接种于阴性实验兔的腿部肌肉或腹腔皮下,注射2d后在注射部位可看到自咬症状,最终死亡,可确诊为PR。但此方法灵敏性不高,不易于大量样品确诊。

8、免疫程序及影响因素:我国猪场一般在新生仔猪出生1~3日龄内通过鼻内接种相关疫苗,70d后进行肌肉接种。对母猪和后备猪进行季度性接种,每年免疫3~4次。PR的疫苗种类有很多,包括弱毒苗、灭活苗、基因工程疫苗、缺失苗、亚单位苗、多价苗等,不同苗的免疫效果存在显著区别。灭活苗安全性明显好于弱毒苗,不会引起机体排毒,使用安全,但其保护效力低于弱毒苗。影响疫苗效果的因素有很多,包括添加的佐剂、免疫途径、宿主自身的免疫功能强弱等。添加佐剂的目的为了提高抗体水平,增强免疫效果,佐剂作用的高低与佐剂的种类有关。

目前,很多欧洲发达国家已经根除猪伪狂犬病,想要根除该病,基因缺失苗的构建和与之相对应缺失蛋白的鉴别诊断至关重要。美国于20世纪末启动PR根除计划,在本世纪初宣布彻底消除,其所用的就是基因缺失苗。英国花费了约2.6亿英镑彻底消除了PR。德国只使用gE缺失苗进行免疫,于2000年彻底净化该病。我国的流行情况较为复杂,虽然PR只存在一个血清型,但存在变异毒株,毒力存在差异,当猪感染伪狂犬病毒后,还会继发感染其他疾病,如猪瘟、蓝耳病等,加大了治疗和防控难度,在我国想彻底净化该病需所有科研人员、兽医工作者共同努力。

版权声明:本文内容来源2018年04月22日的《 中国畜牧兽医报 》,任维广郭继光,如有侵权,请联系我们删除,谢谢。猪伪狂犬病的八种实验室诊断方法
秦委进:一心为民的好兽医-大畜牧

畜禽的守护神,百姓的好兽医,为他们点赞!

上一篇

华农兽医学子与“猪周期”的十年“纠缠”,得出规模化和产业链可破“猪周期”

下一篇

你也可能喜欢

已有 0 条评论

分类栏目

微信扫一扫

微信扫一扫