李曼大会听课笔记 | 李鹏博士《非洲猪瘟下的饲料和饮水解决方案》

2019年第八届李曼中国养猪大会于10月19-21日在郑州国际会展中心举办,10月19日上午, 诺伟司国际贸易(上海)有限公司的李鹏博士做了题目为《非洲猪瘟下的饲料和饮水解决方案》的精彩报告。

李鹏博士先介绍了非洲猪瘟的在不同饲料原料中的存活时间长达37天,然后介绍了在饮用水中的感染剂量只需要1个TCID50(读者如不清楚该含量,可理解为非常非常低的病毒含量即可感染),当猪频繁采食受污染的饲料和饮水时,可大大增加感染风险;而后,李鹏博士介绍了,该酸能降低流行性腹泻病毒(PEDV)和塞尼卡病毒A(SVA)在饲料中的病毒滴度;该酸对PEDV和SVA的抑制作用,李鹏博士进一步验证该酸对非洲猪瘟的抑制作用效果:分别在饲料和细胞上进行验证,经过试验发现该酸能降低饲料中的病毒滴度;细胞试验结果表明当该酸的浓度达到0.05%或以更高浓度加入自来水中时,且其与病毒作用 1min以上,对ASFV即有明确的灭活效果。

诺伟司国际贸易(上海)有限公司 李鹏博士

一、非洲猪瘟病毒

非洲猪瘟病毒(ASFV)曾先后分类入虹彩病毒科/痘病毒科,1995年将其单列为一新的病毒科-非洲猪瘟病毒科,非洲猪瘟病毒属,目前是该科的唯一成员。属囊膜病毒,病毒粒子的特征:六边形,大小约200nm,电子显微镜才能看见。

基因组为双股线状DNA,大小170-190kb。在猪体内,非洲猪瘟病毒可在几种类型的细胞浆中,尤其是网状内皮细胞和单核巨噬细胞中复制。

1、ASFV的流行病学

♠ 易感动物与自然宿主:只感染野猪(包括疣猪)和家猪,不感染其他动物和人。疣猪存在无临床症状的隐性感染。

♠ 传播媒介:软蜱,钝缘蜱为该病毒的生物学媒介和储藏宿主,病毒在蜱体内复制,然后移行到唾液腺生生殖器官,在交配时互相传播。

♠ 传播途径:媒介或直接和间接接触。猪/猪、啮齿动物及农场的其他动物,饮水与饲料、用具、交通工作、人员、废弃物、生猪肉制品等。

在非洲,通过非洲野猪和媒介蜱之间的感染循环持续存在,主要分布在撒哈拉以南,很难根除。临床症状和死亡仅在家猪中可见。

欧洲野猪和家猪对非洲猪瘟病毒高度易感,一旦感染发病严重,常见途径是直接接触。

2、非洲猪瘟病毒(ASFV)在环境中的稳定性

室温,血清中18个月; 冷冻血液中6年; 37℃血液中1月; 23℃及以下血液土壤混合物中4个月;腐败血液中15周;冻肉中15年; 60ºC×30min,20 min可使病毒灭活;粪便中11天以上;

对乙醚、氯仿等脂类溶剂敏感;

pH4 ~10范围内稳定,如有血清,pH稳定范围更宽;

尚未高温蒸煮或烟熏的香肠中3~6个月,腌肉和熏肉病毒可存活300天;

消毒剂: 10%苯酚;0.8%NaOH;2.3%次氯酸盐;0.3% 福尔马林,30 min。

二、非洲猪瘟等病毒能在饲料其原料中存活吗?

答案是肯定的。

根据有关实验,ASFV等众多病毒能在饲料及其原料中存活37天,李鹏博士表示,虽然是实验室模拟数据,但风险是存在的。

三、关于饮水消毒的必要性

自然水体中,ASFV可维持较长时间的感染性,水中如有血液、粪便等有机物污染,可延长病毒存活时间;

饮水中的少量病毒(不超过10HAD50)即可造成感染;

2018.08,罗马尼亚,欧洲第二大猪场,13.5万头-饮水消毒问题。

根据有关实验文献,饲料中ASFV的最低感染剂量为104TCID50,饮水中ASFV的最低感染剂量1个TCID50。

当猪高频率采食受ASFV污染的全价料和饮水会增加感染风险。

图注:不同ASFv在水(蓝线)和饲料(黑线)中的感染剂量和发病概率的关系图。
Niederwerder etal., 2019

四、生物安全是防控非瘟的唯一手段

ASF爆发和感染途径以及剂量密切相关,不同的感染途径最低感染剂量存在不同,低剂量经口就可以感染。

通过文献发现,控制ASFV的病毒滴度可有效降低感染风险。

五、如何能将饲料中的病毒滴度降低呢?

明尼舒达大学兽医院做了相关实验,实验过程如下图所示,发现利用有机酸可以降低饲料中PEDV的传染性。

李鹏博士也做了相关试验,发现有些酸能有效降低饲料中PEDV的活力,但并不是所有的有机酸都有这个功效。

为了进一步验证对病毒活力的一致作用进行了试验,实验发现该酸能有效抑制病毒活力。

而且通过体外实验发现该酸能显著降低饲料中ASFV病毒滴度。

*: Inoculation dose= 5 logs 起始接种量5 logs
Dee 2018. Leman conference

通过活猪实验,李鹏博士还发现该酸可有效缓解病毒感染

通过实验验证
1.添加该酸干预后,PRRSV和SVA不发病,无任何临床症状;不添加,出现病毒疾病。
2.高剂量防控效果好,对生产性能提升显著;低剂量添加,也能起到对病毒性疾病的防御。

为了进一步验证DA对ASFv的作用效果研究,李鹏博士开始了另一个试验,将实验分为实验组和对照组。
试验组:0.6%DA(W/W)混入饲料内,混匀破碎;
对照组:未添加DA的饲料。
分别取50g,铺于A4纸成薄层,安全柜内表面喷106 TCID50/ml ASFV 10ml(尽量模拟被污染的饲料表面)。混合均匀,分装5g/管,室温放置,每周取1份,进行荧光定量PCR。同时取1g混合物加9ml培养基浸泡振荡10min,离心取上清,如上法稀释测定TCID50。
毒株:国内的强株,分离于我国东北地区。

通过荧光定量PCR检测,发现可降低饲料中ASFV的核酸,试验结果如下图

通过测定TCID50发现还能降低饲料中ASFV的滴度。

所以饲料中添加某些酸(有效)可显著降低包括ASFV在内的多种病毒感染活力,提高猪场生物安全。

如何降低水体中的病毒滴度呢?

李鹏博士进行了研究方法设计,使用国内的流行毒株,人工模拟水体污染的模型,测试不同浓度下DA对ASFV的灭活效果。

实验方案一:
病毒浓度:400TCID50/ml
剂量:0、0.05%和0.1%
处理时间:1min、5min、10min、30min
观测时间:48h
处理方式:
取不同浓度酸化水(包括未处理自来水对照)分装入15ml离心管,加入终浓度400TCID50/ml的ASFV-GFP,立即混匀并开始计时,在计时第1~30min不等时间,取与DA作用的病毒液立即加入等体积中止液内,置冰上。收集完各时间点样品后,样品接种PAM 单层细胞,每个样品至少接种2孔,培养48h,观察记录孔内绿色荧光出现情况,始终无绿色荧光出现,作为该孔对应样品ASFV完全灭活的判定标准。

注:酸灭活一定时间后的病毒在PAM上培养并连续观察至48h

实验一结论:

需要以0.05%或更高浓度加入自来水中,与病毒作用 1min以上,对ASFV即有明确的灭活效果。

对试验剂量ASFV完全灭活,需要至少0.1%浓度,作用时间不少于30min,0.05%不理想。

不添加酸的对照组观察到的ASFV荧光量不足,应延长观察时间或增加病毒剂量,以提高检测敏感度,防止假阳性(未完全灭活但未观察到荧光)出现 。

实验方案二:
病毒浓度:1000TCID50/ml
DA剂量:0、0.08%、0.1%和0.15%
处理时间:10-120min
观测时间:96h
处理方式:同实验一
实验结果:

酸灭活后一定时间后病毒在PAM细胞上培养并连续观察至96h

实验二结论:

酸化饮水对ASFV的灭活效果是肯定的,浓度≥0.05%,作用1min以上即有明确效果。

浓度≤0.1%,不足以在120min内实现试验浓度ASFV的完全灭活。

0.15%的浓度在试验条件下可完全灭活试验浓度(103TCID50)ASFV:30min≤ 时间 ≤90min。

李鹏博士的报告数据中表面,饲料或者饮水中含有病毒(非常低含量),高频次的采食,均能导致猪的感染。

由于大环境的污染以及一些猪场匆忙之间在猪场或者猪场附近掩埋大量病死猪,致使附近的地下水中可能携带病毒,给非洲猪瘟的防控或者复养增加很大的难度。

李鹏博士给出的解决方案是在饲料或饮水中加入有机酸,不失为一种方法,另外读者也可以去自己去尝试和实践其他方案。

对于复养场,对猪场环境的严格消毒是必不可少的,科学的洗消流程是复养猪场的必须掌握的技术。

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农业部办公厅关于进一步加强非洲猪瘟风险防范工作的紧急通知(农办医〔2017〕14号)-大畜牧

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